海南粗榧(Cephalotaxus mannii)是三尖杉属(Cephalotaxus)分布最南的种，该属植物主产我国，由于生态幅度较窄以及人为破坏的缘故，其分布区面积在不断缩小，属濒危物种，已于1987年列入国家二级重点保护濒危植物(杜道林等, 2003, 湖南科学技术出版社, 1(4): 16)。海南粗榧的根、茎、叶以及果实都富含多种具有抗癌活性的生物碱，由于自然资源无法满足需求，生物合成一直以来都是研究的热点(蔡长福, 2007)，而克隆和分析这些次生代谢产物相关基因是这些生物碱生物合成的前提和基础(De Luca et al, 2012)。

在三尖杉科植物中已发现的功能次生代谢物有三尖杉酯碱(Harringtonine)和紫杉醇(Paclitaxel, 又名Taxol)，其生物合成代谢途径已基本明了(张长河等, 1996; Gitterman et al., 1980; Jennewein and Croteau, 2001)，但参与合成这些生物碱的基因以及这些次生代谢产物在粗榧中的生物学功能依然不清楚。牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶(geranyl geranyl diphosphate synthase, GGPPs)在次生代谢中，对于众多次生代谢产物前体的代谢方向起着重要调节作用(Coman, 2010)，并且是紫杉醇生物合成途径酶促反应中最上游的酶。因此，本研究拟通过同源克隆的方法获得海南粗榧中GGPPs的基因全长，进行基因信息学分析；并进一步利用不同外源激发子刺激，观察GGPPs基因表达与外源刺激信号的关系，对海南粗榧功能次生代谢产物的生物合成和产量调节提供理论参考。

1结果与分析
1.1 GGPPs基因cDNA的克隆及其序列特征分析
通过利用已报道其他物种GGPPs基因序列所设计的简并引物GGPPs1，对RACE反转录cDNA模板进行PCR扩增，得到一条219 bp的扩增片段。根据测序结果分别设计5’-RACE和3’-RACE的引物进行PCR扩增，获得1 190 bp和504 bp两条序列，序列拼接后得到1 694 bp的GGPPs序列，再根据该拼接序列设计引物GGPPs，将PCR产物连接、转化及测序后，结果显示海南粗榧GGPPs基因cDNA全长1 694 bp，与拼接序列一致(图1)。将该基因提交GenBank，获得登录号为JX971119。

图1 GGPPs基因PCR扩增电泳图 Figure 1 The amplification results of GGPPs

1.2海南粗榧GGPPs基因cDNA全长核苷酸和氨基酸序列分析
经验证所得海南粗榧GGPPs基因cDNA全长为1 694 bp，其中开放编码框(ORF)为1 182 bp，5’非翻译区为337 bp，3’非翻译区为175 bp。共编码393个氨基酸序列，通过ProtParam预测得出其分子量为42.91 kD，等电点(pI)为7.12。

1.3海南粗榧GGPPs基因同源性分析和系统进化树分析
海南粗榧GGPPs基因cDNA全长核苷酸序列和氨基酸序列与已报道的红豆杉科植物GGPPs基因同源性最高，一致性分别是91%和89%。与其他植物的同源性略低，核苷酸序列的一致性在49%~82%之间，氨基酸序列的一致性在67%~71%。除红豆杉科植物以外，与银杏Ginkgo biloba (AAQ72786.1)氨基酸序列同源性最高为71%，其次是云杉Picea abies (ACA21461.1)、北美冷杉Abies grandis (AAL17614.2)、蓖麻Ricinus communis (XP_002531191.1)、拟南芥Arabidopsis thaliana (NP_195399.1)、巴西橡胶Hevea brasiliensis (BAF98302.1)、葡萄Vitis vinifera (CAN78430.1)、苜蓿Medicago truncatula (ADG01841.1)，同源性分别为70%、70%、70%、69%、68%、67%和67% (图2)。

图2 GGPPs氨基酸序列一致性比较分析 Figure 2 GGPPs amino acid sequence alignment

其核苷酸序列与已经报道的其他物种GGPPs基因序列利用DNAMAN构建进化树显示(图3)，12个物种的GGPPs基因核苷酸序列可聚为2大类群，其中将海南粗榧与红豆杉科植物、银杏Ginkgo biloba (EF646377.1)、云杉Picea abies (EU432050.1)等裸子植物聚为一类，它们亲缘关系最近。将拟南芥Arabidopsis thaliana (AK227130.1)、苜蓿Medicago truncatula (GU999999.1)、巴西橡胶Hevea brasiliensis (AB055496.1)、蓖麻Ricinus communis (XM_002525050.1)和葡萄Vitis vinifera (AM472791.2)等被子植物聚为另一类。氨基酸序列比对发现裸子植物GGPPs均比被子植物GGPPs多出一段氨基酸序列(图2方框)。同时，氨基酸序列比对还发现，蛋白质不同区域表现出不同的相似度，C端的催化功能区高度保守，而N端的转运肽区域相似度极小。

图3 海南粗榧GGPPs基因与已知GGPPs基因核苷酸同源性聚类树状图 Figure 3 The phylogenetic tree based on alignment of nucleotide among Cephalotaxus mannii GGPPs gene and some previously published GGPPs genes

1.4不同诱导子处理后海南粗榧GGPPs基因表达量分析
用不同诱导子处理海南粗榧二年生小苗叶片发现，处理后叶片中GGPPs的基因表达量明显上调。利用Harpin (50 mg/L)处理后的叶片与对照相比均在12 h基因表达量达到最大值，而利用MeJA (100 μmol/L)和Flg22 (1 μmol/L)处理后的叶片与对照相比在24 h基因表达量达到最大值。其中MeJA诱导的诱导效果持续时间较长，表达总量较高(图4)。

图4不同诱导子处理后GGPPs基因表达量随时间的变化 Figure 4 Time course of GGPPs transcript abundance in response to different elicitor

2讨论
本研究首次在海南粗榧中克隆了GGPPs基因，并对该GGPPs基因从生物信息学角度如相对分子量、等电点等特性方面进行了分析。通过和银杏(Liao et al., 2004) 、美洲巨杉(Burke and Croteau, 2002)、橡胶树(Takaya et al., 2003)、南方红豆杉(韩飞等, 2011)、甘草(Sithitthitha et al., 2001)和曼地亚哥红豆杉(肖明贵等, 2004; 肖明贵, 2004)等植物中的GGPPs基因对比分析发现，海南粗榧GGPPs氨基酸序列具有裸子植物特有的蛋白块(Block)因此推测本研究得到的GGPPs基因属于裸子植物类群。尽管裸子植物和被子植物2种类群的GGPPs从同一祖先平行进化而来(Liao et al., 2004)，并且催化相同底物，但最终产生不同的二萜类化合物。在红豆杉中，GGPPs基因可酶促反应催化异戊烯焦磷酸(farnesyl pyrophosphate, FPP)与甲基丙烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)缩合反应生成GGPP，然后在GGPPs催化作用下GGPP再经过一系列环化作用而形成紫杉醇的紫杉烷骨架结构。同源性和系统进化树分析表明，海南粗榧GGPPs基因在氨基酸序列和核苷酸序列比对分析下均与红豆杉科植物同源性最高，说明海南粗榧中可能具有紫杉醇合成代谢途径。

尽管三尖杉酯碱和紫杉醇由于具有抗癌效果而广泛应用医学领域，但这些次生代谢物质对于植株自身的生物学功能仍未见报道。本研究利用真菌激发子Flg22、细菌激发子Harpin和模拟昆虫取食造成物理伤害的信号物质MeJA (徐伟和严善春, 2005)进行诱导，发现MeJA对于GGPPs基因的诱导具有持续时间长，强度大的特点，而Flg22的诱导效率较低。而这也和众多利用MeJA诱导细胞悬系产生紫杉醇的研究相符(Laskaris et al., 1999a; 1999b; Nim et al., 2006)。由于诱导后GGPPs的表达量与紫杉醇生成量具有线性相关性(Laskaris et al., 1999a)，因此我们推测紫杉醇在抵御逆境胁迫方面有重要作用，但作用形式尚不清楚，这些次生代谢产物是否对植株起到有效保护仍有待阐明。由于三尖杉酯碱和紫杉醇多被发现存在于进化地位相对古老的植物中并且含量较低，因此，掌握如何有效激活这些次生代谢途径的方法，以及了解参与这些代谢途径中的关键基因有重要意义，也是我们进一步研究的目标。

3材料与方法
3.1材料
   海南粗榧(Cephalotaxus mannii)二年生实生苗新稍叶片。

3.2海南粗榧总RNA提取和cDNA合成
RNA提取参照Axygen公司总RNA小量制备试剂盒说明书方法，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。按照Clontech公司的SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit操作完成RACE反转录cDNA模板合成。

3.3海南粗榧GGPPs基因的PCR扩增、克隆与测序
   根据GenBank上已登录的GGPPs基因序列中，利用亲缘关系相当较近的云南红豆杉DQ364604.1、加拿大红豆杉AF081514.1、曼地亚哥红豆杉AY453404.1的CDS序列保守区，用Primer Premier 5.0软件设计一对简并引物命名为GGPPs1，进行RT-PCR扩增(表1)。根据PCR产物测序结果分别设计5’-RACE和3’-RACE的引物，利用单侧寡聚核苷酸巢式PCR (single oligonucleotide nested PCR, SON-PCR)技术进行两轮PCR反应来扩增GGPPs基因的5’-RACE和3’-RACE (表1)。将获得的PCR扩增产物与PMD-18T Vector载体连接，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，菌落通过Amp抗性筛选和IPTG/X-gal蓝白斑筛选，挑选阳性克隆送测。根据测序结果设计特异引物，扩增GGPPs基因全长(表1)。引物合成与测序交由英潍捷基(上海)公司完成，大肠感菌菌株DH5α为本实验室保存，PMD-18T Vector等试剂均购自TaKaRa公司。

表1 PCR扩增程序 Table 1 The processes of PCR

3.4序列分析及比较
利用DNAMAN和DNAUSER进行序列拼接；基因编码区用ORF Finder程序预测(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)；上下游引物设计采用Primer Premier 5.0软件；核苷酸和氨基酸同源序列搜索通过NCBI中在线BLAST进行(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；氨基酸序列比对以及相似序列系统进化树分析通过DNAMAN构建；蛋白质的相对分子量、等电点用EXPASy的ProtParam tool在线程序(http://web.expasy.org/protparam/)进行预测。

3.5 GGPPs基因半定量RT-PCR分析
根据RACE所得结果拼接、验证得到全长序列；用Primer Premier 5.0设计引物命名为GGPPs2，引物序列分别为GGPPs2-S：CTGATAGGACTTTGAGGGTGA；GGPPs2-A：CCTCCACTCACAACTGAACAT。用NCBI上已登录的海南粗榧18srRNA基因(JF976108.1)作为内参基因，根据该基因的CDS序列保守区，用Primer Premier 5.0设计了另一对引物命名为Cm-18srRNA，引物序列分别为Cm-18srRNA-S：GCTGAAATGAGCACGAGGTCC；Cm-18srRNA-A：CACGAGATAAAGTTTGCCCACA。

分别用MeJA (100 μmol/L)、Harpin (50 mg/L)、Flg22 (1 μmol/L)对海南粗榧二年生实生苗叶片进行0、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h的6个时间段处理，用清水处理作为对照。进行3次重复。RNA提取参照Axygen公司总RNA小量制备试剂盒说明书方法，根据NEB公司反转录试剂盒使用说明将RNA反转录为cDNA，通过半定量RT-PCR分析，利用凝胶成像系统所得电泳图利用Image J软件进行表达分析。处理所用药剂中茉莉酸甲酯(MeJA)购自Promega公司，Flg22由生工生物工程(上海)有限公司合成，Harpin购自EDEN生物科学公司(Messenger^®)。

作者贡献
乔飞和钱丹是本研究的实验设计和实验研究的执行人；钱丹完成数据分析，论文初稿的写作；钱丹和乔飞参与实验设计，试验结果分析；江雪飞和乔飞是项目的构思者及负责人，指导实验设计，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由海南大学青年基金项目(qnjj1217)资助。感谢热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室(海南大学)和农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室给予实验技术和实验设施等帮助。

参考文献
Cai C.F., 2007, Cephalotaxus cell culture and its harringtonine secondary metabolism research, Thesis for M.S., Fujian agriculture and forestry university, Supervisor: Zheng Y.S., pp.3-10 (蔡长福, 2007, 三尖杉细胞培养及其三尖杉酯碱次生代谢的研究, 硕士学位论文, 福建农林大学, 导师: 郑郁善, pp.3-10) 
 
De Luca V., Salim V., Atsumi S.M., and Yu F., 2012, Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making, Science, 336(6089): 1658-1661
http://dx.doi.org/10.1126/science.1217410
PMid:22745417 
 
Gitterman A., Parry R.J., Dufresne R.F., Sternbach D.D., and Cabelli M.D., 1980, Biosynthesis of the Cephalotaxus alkaloids investigations of the biosynthesis of deoxyharringtonine, isoharringtonine, and harringtonine, Journal of the American Chemical Society, 102(6): 2074-2081
http://dx.doi.org/10.1021/ja00526a051
 
Jennewein S., and Croteau R., 2001, Taxol: biosynthesis, molecular genetics, and biotechnological applications, Appl. Microbiol. Biotechnol., 57(1-2): 13-19
http://dx.doi.org/10.1007/s002530100757
PMid:11693909 
 
Coman D., 2010, Regulation of isoprenoid biosynthesis at branch points-the GGPP synthase gene family, Dissertation for Ph.D., ETH Zurich, Supervisor: Wilhelm Gruissem, pp.3-4 
 
Liao Z.H., Chen M., Gong Y.F., Guo L., Tan Q.M., Feng X.Q., Sun X.F., Tan F., and Tang K.X., 2004, A new geranylgeranyl diphosphate synthase gene from Ginkgo biloba, which intermediates the biosynthesis of the key precursor for ginkgolides, DNA Seq., 15(2): 153-158
http://dx.doi.org/10.1080/10425170410001667348
PMid:15352294 
 
Burke C., and Croteau R., 2002, Geranyl diphosphate synthase from Abies grandis: cDNA isolation, functional expression, and characterization, Arch. Biochem. Biophys., 405(1): 130-136
http://dx.doi.org/10.1016/S0003-9861(02)00335-1
 
Takaya A., Zhang Y.W., Asawatreratanakul K., Wititsuwannakul D., Wititsuwannakul R., Takahashi S., and Koyama T., 2003, Cloning, expression and characterization of a functional cDNA clone encoding geranylgeranyl diphosphate synthase of Hevea brasiliensis, Biochim. Biophys. Acta, 1625(2): 214-220
 
Han F., Kang L.Z., Guo L.Q., Chen X.Y., and Lin J.F., 2011, Molecular cloning and sequence analysis of geranyhlgerany pyrophosphate systhase from Taxus wallichiana var. Mairei, Shipin Yu Shengwu Jishu Xuebao (Journal of Food Science and Biotechnology), 30(5): 728-733 (韩飞, 康林芝, 郭丽琼, 陈晓阳, 林俊芳, 2011, 南方红豆杉GGPP合酶基因的克隆与生物信息学分析, 食品与生物技术学报, 30(5): 728-733)
 
Sithitthitha W., Kojima N., Viroonchatapan E., Suh D.Y., Iwanami N., Hayashi T., Noji M., Saito K., Niwa Y., and Sankawa U., 2001, Geranylgeranyl diphosphate synthase from Scoparia dulcis and Croton sublyratus. Plastid localization and conversion to a farnesyl diphosphate synthase by mutagenesis, Chem. Pharm. Bull., 49(2): 197-202
http://dx.doi.org/10.1248/cpb.49.197
 
Xiao M.G., 2004, Cloning and analysis of plants Taxus media GGPP synthase, Thesis for M.S., Huazhong University of Science and Technology, Supervisor: Yu L.J., pp.1-46 (肖明贵, 2004, 曼地亚红豆杉植株中GGPP合成酶的克隆与分析, 硕士学位论文, 华中科技大学, 导师: 余龙江, pp.1-46) 
 
Xiao M.G., Yu L.J., Liu Z., Cheng H., Xiang F., and Zhou Z.D., 2004, Cloning and analysis of a cDNA fragment encoding geranylgeranyl diphosphate synthase in Taxus media, Zhongguo Shengwu Gongcheng Zazhi (China Biotechnology), 24(2): 45-50 (肖明贵, 余龙江, 刘智, 程华, 向福, 周智德, 2004, 曼地亚红豆杉植株中GGPP合成酶的克隆与分析, 中国生物工程杂志, 24(2): 45-50)
 
Laskaris G, De Jong C.F., Jaziri M., Van Der Heijden R., Theodoridis G., and Verpoorte R., 1999a, Geranylgeranyl diphosphate synthase activity and taxane production in Taxus baccata cells, Phytochemistry, 50(6): 939-946
http://dx.doi.org/10.1016/S0031-9422(98)00645-1
 
Laskaris G., Bounkhay M., Theodoridis G., van der Heijden R., Verpoorte R., Jaziri M., 1999b, Induction of geranylgeranyl diphosphate synthase activity and taxane accumulation in Taxus baccata cell cultures after elicatition by methyl jasmonate, Plant Science, 147(1):1-8
http://dx.doi.org/10.1016/S0168-9452(99)00078-3
 
Nim E., Dubois C.P., Robert S.C., and Walker E.L., 2006, Expression profiling of genes involved in paclitaxel biosynthesis for targeted metabolic engineering, Metabolic Engineering, 8(5): 385-394
http://dx.doi.org/10.1016/j.ymben.2006.04.001
PMid:16793302 
 
Zhang C.H., Liao Y.H., and Luo P.,1996, Tissue culture of Cephalotaxus fortunei Hook.f. a Potential taxol alternative resource, Shengwu Jishu (Biotechnology), 6(5): 17-18 (张长河, 廖衍慧, 罗鹏, 1996, 三尖杉的组织培养—紫杉醇来源的新途径, 生物技术, 6(5): 17-18) 
 
Xu W., and Yan S.C., 2005, The function of Jasmonic acid in induced plant defence, Shengtai Xuebao (Acta Ecologica Sinica), 25(8): 2074-2082 (徐伟, 严善春, 2005, 茉莉酸在植物诱导防御中的作用, 生态学报, 25(8): 2074-2082)